MODEL INTERAKCIJE KRATKIH PEPTIDA SA DVOSTRUKOM SPIRALOM DNK

 Poređenje prostornog uređenja funkcionalnih grupa nukleotidnih osnova (baza) na površini velikog kanala dvojne spirale DNK i funkcionalnih grupa kratkih peptida ukazuje na to, da ove poliamfolitne strukture imaju mogućnost višestruke dopunske interakcije (uzajamnog dejstva). Kao primer, dat je model dopunske veze sintetičkog tetrapeptida epifize Ala-Glu-Asp-Gly sa nizom nukleotida ATTTS u vodeći lanac dvojne spirale DNK, koje se ponavlja na početnim delovima gena telomeraze i RNK polimeraze II. Pokazano je da regulatorni peptidi i njihove dopunske jedinice u dvostrukoj spirali DNK mogu biti povezane sa proton-donatorom i proton-akceptorom koji su u interakciji, s učešćem molekula hidratacione vode.

 Poznato je da normalne ćelije reaguju na spoljne ili unutrašnje promene u intenzitetu promena transkripcije (prenošenje sa jednog na drugi) aktivnih gena i sinteze RNK. Jedan od faktora patološkog stanja tela usporava te procese, a posebno, poremećaj procesa inicijacije transkripcije. U isto vreme, utvrđeno je, da su neki proteini, koji kontrolišu ćelijski ciklus, bili aktivni kao faktori transkripcije. Pitanje mehanizma inicijacije transkripcije rešava se proučavanjem strukture transkripcionih faktora i određivanje njihovih obavezujućih lokacija sa dvostrukom spiralom DNK na početnom (nekodiranom) delu gena. Od pojave prvih studija iz ove oblasti u ranim 80. pronađeni su zajednicki strukturni motivi u strukturi transkripcionih faktora nekih gena i njihovih kompleksa sa određenim povezanošću nukleidnih parova u dvostrukoj spirali DNK početnih delova gena. Otkriveno je, da se ćelijska aktivacija hromatina i kontrola transkripcije sprovodi složenim sistemom transkripcionih faktora i agonista, uključujući i visoko-molekularne proteine, kao i malo-molekularne peptide i kratke peptide.

 Tada se činilo, da je specifična aktivnost mnogih visokomolekularnih transkripcionih faktora lokalizovana na relativno kratkom delovima peptidnog lanca koji se sastoji od 30-100 aminokiselinskih ostataka. Ova zapažanja su identifikovala novi problem farmakologije i medicine. Trebalo je utvrdi, koja minimalna dužina i aminokiselinski ostatak kratkih peptida, direktno i selektivno kontaktiratira sa početnim delom gena i koji je u stanju da imitira dejstvo faktora transkripcije. Više detalja molekularnih mehanizama transkripcije u ćelijama dat je u literaturi.

 Uobičajeni pristup za određivanje lokacije povezivanja u strukturi proteina je korišćenje imunospecifičnih metoda. Na primer, bio je definisan V-lanac laminina, koji se sastoji od 14 aminokiselinskih ostataka, koji je odgovoran za atheziju epitelnih ćelija. Dalja istraživanja su pokazala da ovaj peptid može biti skraćen na pet aminokiselinskih ostataka sa potpunim očuvanjem selektivnosti vezivanja sa receptorom. Sličan problem je predstavljao i praktično je rešen za peptidni hormon eritropoetin. Hormon eritropoetin (MM 46000), promoviše proliferacije, diferencijacije i preživljavanja ćelija-prethodnika eritrocita. U grupi peptida pronađeni su kratki peptidi (14 aminokiselinskih ostataka), koji su pokazivali dejstvo slično naslednom hormonu.

 U isto vreme su identifikovani i ispitani endogeni regulatorni peptidi čoveka, koji su pokazali specifične aktivnosti tkiva, kada se koriste u veoma malim koncentracijama. Studija produkata hidrolize hemoglobina i peptida, sadržanih u hranljivoj sredini tokom kultivacije ljudskih crvenih krvnih zrnaca, pokazalo je da kratki segmenati lanaca globina su aktivni, neuobičajeno za početni hemoglobin: oni se vezuju za opijatne receptore, potenciraju delovanje bradikinina. Regulatorni peptidi su takođe izolovani iz žive kulture ćelija koštane srži, ispitane u pogledu posebne regulatorne aktivnosti i nazvani su mielopeptidima.

 Nedavno je i eksperimentima dokazala da prirodni peptidni preparati, kao i njihovi sintetski analozi - tetrapeptidi specifične strukture - pokazuju specifične delatnosti tkiva, učestvuju u aktiviranju hromatina i normalizaciju ritam sinteze proteina u kulturi tkiva i na nivou organizama. Može se pretpostaviti da kratki peptidi, koji podržavaju autokrinu regulaciju, postaju mimetici i agonisti visokomolekularnih transkripcionih faktora.

 Mehanizmi penetracije kratkih peptida u ćeliju i ćelijaski nukleus mogu biti različiti. Prema I.P.Ašmarinu, mehanizam prodora neuropeptida u ćeliji i gene neurona je sličan mehanizmu prodora steroidnih hormona. Više hidrofilnih kratkih peptida, za razliku od steroidnih hormona, za savladivanje membrane lipida vezuju se sa hidrofilnim grupama fosfolipida na spoljašnjoj strani membrane, grupišu se i ulaze u ćeliju, koristeći mehanizam sličan pinocitozi. Formiranje kompleksa "protein-protein" i njihovo razdvajanje – opšti je mehanizam unutarćelijskih transportnih procesa. U citoplazmi se nalaze receptori steroida, koji su u strukturi "C4 cinkovi prst". U odsustvu steroidnih hormona taj receptor je povezan sa proteinima HSP 90 (heat stock protein), koji je uvek prisutan u citoplazmi. Pri pojavi steroidnog hormona, taj neaktivni kompleks se razbija, i steroidni hormon se vezuje za receptor, formirajući aktivni kompleks, koji se prenosi do jedra, gde se vezuje za regulatorni deo celog gena i aktivira (ili potiskuje) njegovu transkripciju.

 Moderni pogledi na propustljivost citoplazmi i nukleidne membrane pokazuju da penetracija kroz ove membrane i difuzione puteve postoji.

 Pored ranije poznatih jonskih kanala i procesa pinocitoza, bili su otkriveni kanali, formirani familijom transmembranskih porins proteina, prisutnih u mitohondriji i citoplazmi membrane. Ovi proteini sadrže do 50% hidrofilnih aminokiselina i strukturnih motiva amfifilne a-spirale. Medutim, većina peptidnih lanaca nalazi se u p-usaglašenosti. Nekoliko transmembranskih porins lanaca obrazuju pore bacvastog oblika (barrel-shaped), koje su porozne za male hidrofilne i amfifilne molekule (urea, glicerol, triptofan, itd.). Na primer, pri razlici u koncentracijama triptofana 0.001 M, njegov difuzioni protok kroz membranu je 600 molekula po sekundi na 1 µm2 površine membrane.

 Grupa porinsa uključuje podgrupe akvaporinsa - proteine koji kontrolišu protok vode u ćeliju i iz ćelije u skladu sa malim promenama u pH okoline.

 Nukleidne membrane takođe imaju razvijen sistem transportnih pora, formiranih proteinskim kompleksima - nukleoporama koje kontrolišu saobraćaj nukleoproteinskih kompleksa u jezgro i iz jezgra. Unutrašnji prečnik nukleopora je reda 42 nm, tako da propuštaju molekule sa molekulskom masom od 5000 Da.

 Dakle, mogućnost prodiranja kratkih peptida u ćeliju i jezgro ćelije ne izaziva nikakve suštinske sumnje. Naše eksperimentalne studije su u skladu sa pretpostavkom penetracije kratkih peptida u ćeliju i njeno jezgro, jer ubacivanjem peptida u strukturu ćelije izaziva promene u sastavu hromatina. U literaturi je bilo dokazano, da u ćelijama u strukturi tkiva, kratki sintetički peptidi ne samo da uđu u celiju, kroz citoplazmu i nukleidne membrane, već i učestvuju u aktiviranju pojedinih gena, naročito gene telomeraze.

 Proučavanjem, otkriveno je dejstvo kratkih sintetičkih peptida na promene heterohromatina u leukocitima i aktiviranje ribozomalnih gena, dekondenzacija gusto zbijenih vlakana hromatina, kao i oslobadanje gena, utisnutih u rezultate starosne kondenzacije euhromatizovanih delova celija.

 Međutim, do danas postoji očigledne razlike između brojnih zapažanja regulatornih dejstava neurohormona i sintetičkih oligopeptida na stanje hromatina i koncepta molekularnih mehanizma selektivnog vezivanja ovih peptida sa početnim delovima gena.

 Među kratkim sintetičkim peptidima, prethodno ispitanih u pogledu aktiviranja hromatina, najefikasniji se pokazao sintetički tetrapeptid epifize (Ala-Glu-Asp-Gly). Ovaj peptid je, takođe, od posebnog značaja, jer pokazuje visoke geroprotektivne aktivnosti. Istraživane su strukturne karakteristike ovog peptida kako bi se pronašle sličnosti između parametara, specifične za ove peptide, na koje utiču aminokiseline i nukleotidi u strukturi dvostruke spirale DNK. Predlože se model specifičnog vezivanja peptida na bazi prepoznavanja sa početnim delovima gena, izgrađenih na principu geometrijske i elektrohemijske komplementarnsti dva pravospiralna molekula - peptida i dvostruke spirale DNK.

Osnove dopunskih interakcija u 
sistemu "oligopeptid - oligonukleotid"

 Cilj našeg istraživanja bio je u pronalaženju mogućeg mehanizma za selektivno prepoznavanje i vezivanje kratkih peptida sa delom genetskog aparata, koji je odgovoran za pokretanje sinteze proteina.

 Mehanizam prepoznavanja u sistemu "peptid - DNK" po principu "jedna aminokiselina - jedan par nukleotida" ne može biti specifičan. Od 20 aminokiselina najmanje 8 može istovremeno da komunicira sa funkcionalnim grupama dva susedna bazna para, jer su prilično dugi i kreću se po površinama funkcionalnih grupa. Medutim, selektivnost takvih veza je nizak. Aminokiseline sa aromaticnim bočnim grupama mogu se vezati za dvostruke spirale DNK, kao rezultat interakcije aromatičnog prstena aminokiseline i nukleotida.

 Veća selektivnost (izbor) prepoznavanja i povezivanja obezbeđuje mnogobrojnu ko-operativnu interakciju u sistemu "oligopeptid - oligonukleotid".

 Molekularno prepoznavanje u oblasti biologije je zasnovan na tačnom odnosu molekularnih površina interakcijskih molekula i slučajnosti dimenzionih parametara rasprostranjenih na toj površini interakcijskih funkcionalnih grupa. Strukturne veze ove vrste nazivaju se matričom komplementarnosti.

 Peptidni lanac koji se sastoji od L-izomera može imati više sastava. Konkretno, R-strukturni oblici peptidnih lanca imaju najčešće izduženi oblik i odnose se na proširenu vrstu peptidnih sastava, u kojim je udaljenost izmedu aminokiselinskih ostataka jednako. Ovaj oblik obezbeđuje dovoljnu slobodu bočnih grupa i omogućava im da izvrše najveći broj medumolekularih interakcija. Orijentacija bočnih grupa aminokiselinskih ostataka zavisi od mogućnosti medumolekularne interakcije sa drugim makromolekulima ili sa komponentama životne sredine.

Slika 1. Ortogonalna projekcija proširenog sastava peptida Ala-Glu-Asp-Gly (projekcija na površinu). Prikazene su krajnje i bočne funkcionalne grupe, sposobne za dopunske interakcije sa DNK.

 Zadebljana linija označava osnovni peptidni lanac. Atomi osnovnog peptidnog okvira nisu označeni, atomi vodonika i kiseonika, koji pripadaju površini peptidne veze, nisu prikazani:

- NH3 - proton donorne grupe,
- O - proton akceptorne grupe,
- CH3 - hidrofobna (metalna) grupa.

 U izgradnji modela matrice komplementarnosti tetrapeptida sa odgovarajućim učešćem dvostruke spirale DNK korišćeni su objavljivani podaci o geometrijskim karakteristikama dvostruke spirale DNK i peptidnog lanca i obrasci interakcije DNK sa poliamfolitamima.

 U konkretnom slucaju u studiji karakteristika sastava tetrapeptida Ala-Glu-Asp-Gli pronađeno je, da eneretski najpovoljna usaglašenost u vodenom rastvoru (homogeno okruženje) ima maksimalnu dužinu od 5.15 A, maksimalnu širinu od 8,5 A. U fiziološkim uslovima, odnosno, u neutralnom okruženju pH u rastvoru neskomolekularnih elektrolita i pri mnogobrojnim interakcijama sa DNK, koji određuju distance između nukleotidnih parova, ovaj tetrapeptid ima izduženi oblik proširene r-strukture sa transkonfiguracijskim rasporedom bočnih grupa tih ostataka.

 Očigledno, kao rezultat međusobnog odbijanja između susednih negativno naelektri-sanih bočnih grupa ostatka glutaminske i asparaginske kiseline i granične karboksil-ne grupe, njihova usaglašenost će biti energetski povoljna.

 Nukleotidni parovi dvostruke spirale DNK u aktivnom hromatinu rasporedeni su jedan nad drugim, gotovo u paralelnoj ravni. Na jednu zavojnicu dvostruke spirale DNK dolazi 10 baznih parova, prosečno rastojanje između ravni baznih parova je 3,4 A. Poznato je, da fosfodiesterna osnova lanca deli poprečni presek dvostruke spirale DNK na dva nejednaka dela. U tom smislu, na molekularnoj površini dvostruke spirale DNK razlikujemo veći i manji kanal širine od 22,2 A i 11,8 A, odvojene sa dva fosfodiesterna lanaca.

 Na slici je prikazana ortogonalna projekcija na ravan stranica r-usaglašenosti tetrapeptida Ala-Giu-Asp-Gli. Ovaj tetrapeptid sa prilično glomazanim bočnim grupama, samo u većem kanalu dvostruke spirale DNK je u interakciji sa funkcionalnim grupama, koje su izložene na površini tog kanala nukleotidnim parovima dvostruke spirale. Interakcija peptida sa manjim kanalom dvostruke spirale je energetski nepovoljan zbog međusobnog odbijanja fosfatnih grupa DNK i karboksilnih grupa peptida.

 Dakle, dvostruka spirala DNK i peptidni lanac imaju određene dimenzije: dužina peptidnog lanca u r-usaglašenosti, pripisuje se velicini jedne aminokiseline, i iznosi 3,47 A, a rastojanje između baznih parova u DNK lanca jednaka je 3,4 A. Pošto oba učesnika u interakciji imaju pravospiralnu orijentaciju glavnih lanaca, to peptid, bez daljeg stresa, može se postaviti u veliki kanal DNK. To dovodi do mnogobrojnih međumolekularnih interakcija peptida i DNK, uključujući polarne i hidrofobne grupe oba učesnika.

 Kada tražite nizove nukleotidnih parova, komplementarnih ovom tetrapeptidu, po rasporedu proton-donatora, proton-akceptora i hidrofobnih grupa, uzimaju se u obzir strukturne karakteristike lokacije nukleotidnih parova na površini velikog kanala DNK, podatke o interakcijama između parova aminokiselina i peptida sa nukleinskim osnovama i ocena elektrostatičkog potencijala površina DNK. U isto vreme igraju ulogu orijentacijione interakcije peptida sa nukleinskim osnovama.

 Najviše polaznih (nekodiranih) delova gena sadrže u lanacima mnogobrojna ponavljanja relativno kratkih sekvenci (nukleotidnih jedinica). Dužina takvih blokova obično je 6-10 baznih parova (bp), odnosno, manje od jednog zavoja dvostruke spirale. U strukturi transkripcionih faktora i regulatornih peptida su, takođe, sadržane ponavljajuće sekvence aminokiselina, koje se obično sastoje od 5-6 aminokiselinskih ostataka (AO dalje) u peptidnom bloku. Pretpostavljamo da ponavljanje nukleotidnih blokova na početnim delovima gena su mesta selektivnog vezivanja za peptidne blokove, koji se vraćaju u sastav regulatornih peptida. Regulatorni peptid i određena sekvenca nukleotida DNK znaju jedni druge u slučajevima u kojima aminokiselinska sekvenca na dovoljnoj dužini lanca dopunski određuje raspored funkcionalnih grupa nukleotidnih jedinica u velikom kanalu dvojne spirale DNK.

 Dimenzione karakteristike lokacije funkcionalnih grupa pojedinačnih nukleotidnih parova, koji su na površini velikog kanala dvostruke spirale DNK pri objedinjavanju nukleotidnih parova u opštu strukturu, određuju potencijal molekularne površine velikog kanala. Jasno, svaka jedinica nukleotidnih parova eksponira na površinu velikog kanala DNK svoju jedinstvenu osobinu funkcionalnih grupa. Ove grupe mogu da učestvuju u vodoničkim, jonskim vezama i hidrofobnim interakcijama sa peptidnim lancima, ako je lokacija bočnih grupa peptida dopunski odgovara tim osobinama.

Model dopunske interakcije tetrapeptida 
Ala-Giu-Asp-Gli (AEDG) sa dvostrukom spiralom DNK

 Za naše istraživanje smo odabrali grupu visokomolekularnih faktora transkripcije, koje imaju karakteristike "spirala-petlja-spirala", strukture koje su detaljno izučene. Mnoge od njih su uključene u pokretanje transkripcije vitalnih gena: telomeraze i RNK polimeraze II. Poznato je da deo petlje ovih proteina se sastoji od 14 ostataka, uglavnom asparaginske, glutaminske aminokiseline i treonina. Proučili smo sintetički peptid koji je kvalitativno sličan ovoj petlji, po odnosu hidrofilnih i hidrofobnih grupa.
 Međumolekularna interakcija između peptida AEDG i DNK sprovodi se u obliku vodoničnih veza između funkcionalnih grupa oba učesnika. Dužina vodonične veze u ovim sistemima obično iznosi 2.0-2.5 A, odnosno, veća je od polovine rastojanja između površina uparenih osnovnom dvojnom spiralom. Preredospodela nukleotidnih parova bila je određena njihovom sekvencom ATTTS, koja je komplementarna tetrapeltidu AEDG.

Slika 2. Ortogonalna projekcija modela dopunske veze 
tetrapeptida Ala-Giu-Asp-Gli sa dvostrukom spiralom DNK

 Pri izgradnji modela dopunskih medumolekularnih veza tetrapeptida sa DNK uzima se u obzir dužina kovalentnih veza 1.5 A, jon-jonske veze 2,5 A i vodonična veza 2.0-2.5 A. Mogućnost promene uglova nagiba površina nukleotidnih parova, u odnosu na osu dvostruke spirale, nisu razmatrane.

 Na slici je ortogonalna projekcija peptida, u kombinaciji sa jedinicom nukleotidnih parova dvostruke spirale DNK. Prikazano je, kako je tetrapeptid AEDG razmešten u velikom kanalu dvostruke spirale DNK, u skladu sa zahtevima komplementarnosti funkcionalnih grupa tog tetrapeptida sa funkcionalnim grupama nukleotidnih parova. Specificnost predloženog modela je činjenica, da je peptid u velikom kanalu istovremeno u interakciji sa osnovama funkcionalnih grupa obeju lanaca dvojne spirale DNK.

 Treba napomenuti, da je sličan raspored funkcionalnih grupa na površini velikog kanala dvojne spirale za nukleotidne parove A - T i G - C, visoka mobilnost funkcionalnih grupa, krajnjih aminokiselinskih ostataka alanina i glicina, kao i varijabilnost ugao nagiba ravni nukleotidnih parova u odnosu na osu dvojne spirale koji dozvoljava tetrapeptidu AEDG dopunsku vezu sa sekvencama ATTTG, GTTTC, STTTS, iako će snaga ovih veza biti slabija, nego sa ATTTS.

 Kao što je već pomenuto, tetrapeptid AEDG je od posebnog značaja zbog svoje visoke geroprotektorske efikasnosti. U eksperimentima na životinjama, pokazuje značajan uticaj na povećanje očekivanog životnog veka i sprečavanje procesa maligne transformacije tkiva. Postoji hipoteza da je ukupna dužina vremena postojanja ćelijskih populacija u korelaciji sa dužinom telomera hromozoma, a time i aktivnost enzima telomeraze. U procesu ćelijske proliferacije smanjuje se broj ponavljanja TTAGGG na krajnjim delovima hromozoma, zbog problema sa replikacijom. To stalno skraćivanje se može prevazići ako ćelija ima dovoljno visok nivo aktivne telomeraze. Većina normalnih somatskih ćelija nemaju aktivne telomeraze, i skraćenje telomera završava se gubitkom vitalnosti takvih ćelija.

 Koristeci podatke iz literature, otkrili smo da redosled nukleotida ATTTS, određuje sa modelom dopunskih interakcija peptid – DNK, koji se nalazi 9 puta u sastavu početnog dela telomeraze gena (na intervalu 3729 bp od početka transkripcije). Očigledno, dopunske interakcija peptida AEDG sa jedinicama ATTTS može da dovede do reaktiviranja telomeraznog promotera u somatske celije, koje iniciraju unutarćelijsku sintezu telomeraze, istezanje telomera, povećanje proliferativnog potencijala tkiva, i na taj način može značajno uticati na životni vek.

 Specificni gen, koji se nalazi u subtelomernoj oblasti takođe sadrži blok ATTTS u sastavu svog početnog dela i može da posluži kao osnova povezivanja sintetičkog tetrapeptida epifize.

 Jedan od uzroka starenja je usporavanje sinteze proteina. Transkripcija svih proteinskih gena prenosi se enzimom DNK – zavisne RNK polimeraze II, nakon pokretanja ovog procesa faktorima transkripcije. Biosinteza RNK polimeraze II, takođe, ne može biti sproveden bez pokretanja transkripcije odgovarajucim FT. Ranije u literaturi je objavljeno, da je blok ATTTGCAT jedan od mesta povezivanja FT RNK polimeraze II. Na početnom delu gena velike subjedinice RNK polimeraze II niz ATTTS sreće se 3 puta na vodećem lancu, i 5 puta na sastavu lanaca (antiparalelni), a niz ATTTG - 6 puta.

 U tekućoj literaturi, može se pronaći značajan broj publikacija o regulatornom dejstvu kratkih peptida. Razlika između visokomolekularnim faktorima transkripcije i kratakih peptida, koji su uključeni u pokretanje transkripcije gena, se manifestuju pre svega u procesima transporta ovih molekula, iz okoline u jezgra ćelija. Pored toga, kratki peptidi su tkivno specifični, ali nisu po vrstama specifični i ne pokazuju imunogenost.

 Naši predloženi modeli molekularne interakcije kratkih peptida sa dvostrukim spiralama DNK na početnom delu gena zaslužuje eksperimentalnu verifikaciju na nivou fizičko-hemijskih istraživanja sintetičkog sistema "oligopeptid - oligonukleotid".

Zaključci:

 Strukture peptida i dvostruke spirale DNK obezbeduju uslove za prepoznavanje i dopunsko povezivanje peptida za određenu jedinicu nukleotida u funkcionalnim grupama na površini velikog kanala dvostruke spirale DNK u oblasti početnog dela gena. U povezivanju učestvuju oba lanca dvostruke spirale DNK. Predložene metode molekularnog modelovanja dopunskog povezivanja peptida na početnom delu gena može biti korisno za pronalaženje potencijalno aktivnih kratkih peptida – mimetici faktora transkripcije – prema redosledu nukleotida na početnom delu celokupnog gena.

Literatura:

 1. Havinson V.H., Šateva L.K.: Model dopunske interakcije kratkih peptida sa dvostrukom spiralom DNK, Med. akad. casopis, 2005. T. 5, No 1, S. 15-23, Sankt-Peterburgški Institut za bioregulaciju i gerontologiju SZO RAMH, Institut za makromolekularna jedinjenja RAN, Sankt-Peterburg.